Q、客户想用肝脏穿刺取标本做组织芯片，要注意什么？

A：做芯片前先明确定位：一般客户提供给我们的是一个包埋好临床样本的石蜡块，我们一般的做法是先做一个HE染色，看一下它的病理结构，然后再去打孔，就是把那个染完色之后要看的病理位置打一个孔，融入到一个芯片蜡块上，做成组织芯片，然后再去切片，染色。包埋好芯片蜡块一旦制作完成，要连续一次性切完，因为每次切都不会剩下太多，然后这个做对应的组化、染色、荧光都可以。

样本准备：客户会有两种情况，一种就直接让病理科包成蜡块提供给我们，还有一种他们是直接冻存的新鲜组织，组织拿出来，不要等它融化，再丢到固定液，要直接把那个冻好的丢到固定液里面泡着给我们就好了。客户一定要做好样本编号登记，便于后期实验和数据分析。我们可以出具一份电子版的表格客户填写，因为后面芯片的排序，都是要对着那个电子版的编号去做的。组化关键一步是抗原修复，泡的久抗原丢失，做出来可能是阴性，常规的芯片蜡块96个点和150个点的。再有，看她后期的实验，如果她是要做荧光，那最好是组织取出来直接放-80冻，如果做组化，那就包埋。

Q、心肌肥大动物造模好造吗？用几个周期的老鼠比较好？

A：目前来说，心肌肥厚模型建立还是比较成熟的，只要弄清了心肌肥厚的原理就不难理解建立模型的方法。原理比如有压力负荷的改变、容量负荷的改变和激素的诱导等。因此可以用诱导高血压（ 压力负荷的改变 ）、 造漏（ 容量负荷的改变 ） 以及甲肾上腺素（ 激素的诱导 ）等方法建立心肌肥厚模型。原理其实比较简单，但机制就非常复杂。并且不同的模型建立方法有各自的优缺点，因此要根据自己的实验目的采用适当的模型建立方法。

Q、血液、血浆、血清这三者的区别？

A：血液：由液体成分的血浆和悬浮于其中的血细胞组成，合称为全血。

血浆：离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，即血浆。

血清：离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体，即血清。粗略的说，血清与血浆的区别，主要在于血清不含纤维蛋白元。

血液样本运输

全血：抗凝管   短期保存    -20/-80 尽快

血浆：抗凝管   冻存管        -20/-80尽快

血清：凝血管   2h分离       -20/-80一般是过夜，但是测外泌体的话还是建议尽快

Q、一个好的疾病模型应具有什么特点？

A：1、再现性好，应再现所要研究的人类疾病，动物疾病表现应与人类疾病相似。

2、动物背景资料完整，生命周期满足实验需要。

3、复制率高。

4、专一性好，即一种方法只能复制出一种模型。

任何一种动物模型都不能全部复制出人类疾病的所有表现，动物毕竟不是人体，模型实验只是一种间接性研究，只可能在一个局部或一个方面与人类疾病相似。所以，模型实验结论的正确性是相对的，最终还必须在人体上得到验证。复制过程中一旦发现与人类疾病不同的现象，必须分析差异的性质和程度，找出异同点，以正确评估。

Q、细胞因子检测是什么？

A：细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质，在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达，或表达减少，从而参与疾病的发病及病理过程。故细胞因子的检测无论是对免疫学、分子生物学的基础研究，还是对阐明某些疾病的发病机理，指导临床治疗均有重要意义。

细胞因子的检测方法一般分为免疫学、生物学及分子生物学测定法。

1、免疫学检测法 其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。

2、生物学测定法 其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。

3、分子生物学测定法 目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。

Q、你们公司做过巨噬细胞富集培养吗？

A：对于巨噬细胞的富集培养，有直接经验的是小鼠脾脏巨噬细胞的分离培养，一般可以获得较大量的巨噬细胞。但是巨噬细胞在体外不增殖，一般3天后会有一半的细胞死掉。也因此，通常会加入细胞因子刺激巨噬细胞生长。如果客户做大鼠或小鼠的脾脏巨噬细胞，没有问题。我们分离好的细胞，纯度应该在80%左右。客户可以直接把细胞拿走，也可以把后续的实验交给我们来处理。

Q、细胞的基因敲除和过表达指的是什么？

A： 基因敲除（knockout）是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知，但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

过表达（over-expression）简明扼要的说就是，本来基因表达是受到各种内外信号的精确调控的，一旦这种调控机制的任何一个环节出现问题就会失控。基因的表达过程就可能进入失控状态，就有可能表现为表达过度，即该基因被过度的转录、翻译，最终基因表达产物超过正常水平。

基因敲减（knock-down）是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。

Q、原代细胞注意事项?

A：原代细胞培养有2个关键问题：

1、纯度；原因是从动物身上的组织中分离细胞，无法避免会有其他细胞类型在里面；

2、足够的量。原因是原代分离的细胞数量有限，若需要大量的细胞，一个方法是动物数量上去但工作量很大，且每次实验都要分离原代细胞，一个方法是传代但传代后细胞的表型会逐渐失去。

Q、脑组织做TTC染色取材的注意事项?

A：做TTC染色，取样方法：取材时断头取新鲜脑组织（不要灌注、不要固定），放在液氮中，取材结束后转移到-80度保存即可。

Q、脑组织取材和冰冻切片的注意事项?

A：取脑组织，为了保证形态完整，最好选择预冷生理盐水灌注，排净血液后换成4%多聚甲醛灌注（原因在于脑组织比较大，浸泡短时间内难以固定到深层组织；同时脑组织含有酶非常高，固定不到位，容易降解）。 取脑后，直接放在预冷的4%多聚甲醛固定，固定液的量要至少10倍

脑体积。

后面做冰切，固定过夜后（可以根据实际情况适当延长3天内没有问题），用梯度蔗糖溶液脱水：15%蔗糖溶液脱水12h，随后换成20%蔗糖溶液12h，最后30%蔗糖溶液脱水至组织下沉，表明脱水彻底。再将组织OCT包埋，进行冰切。

注意事项：

A、如果脱水不彻底，很容易产生冰晶，片子会有很多空洞。

B、组织在OCT包埋前，不要冰冻，特别在多聚甲醛固定、组织运输过程中（常温运输即可，如果可以非常在意，可以冰块运输，不要用低温冰袋否则可能温度过度组织产生冰晶）。

Q、关于石蜡切片和冰冻切片的区别是什么？

A： 总体而言，以现在的技术稳定和性能，一般情况下石蜡切片比较好。但两种技术各有优缺点，不能一概而论。具体而言，石蜡切片的组织形态保存更好，冰冻切片的抗原性保存更好。

石蜡切片的优点在于可以容易的存放在室温，而且可以切到4微米左右，得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

冰冻切片操作相对简单，做免疫组化时不需抗原修复这一步，缺点是切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮，并且有抗原弥散的风险进而不易观察抗原分布情况。

Q：什么是硬组织切片？

A、硬组织切片其实和石蜡切片的本质是一样的，硬组织切片主要应用于骨组织、牙齿等含钙量非常高的组织，这些组织中被植入了一些物质，如钢钉、金属丝等，不能进行脱钙检测，或者脱钙后一些结构无法看到，所以需要保持组织原来的结构。硬组织切片使用塑料包提，塑料浸入到组织中，使用切割机来将组织切开，然后打磨薄片，贴在塑料载玻片上。

Q：为什么我的免疫组化实验没有结果？

A：免疫组化实验染色结束后，切片中见不到任何阳性信号的可能有：

1、真阴性结果；整个染色中没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原

2、假阴性结果：即此阴性结果是真实的反映。

假阴性结果又可分为几种情况：

a、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞，就是说没有取到所要检测的组织，出现这种情况，可能是病理医生选择错了切片或抗体选错了，也可能是技术员选错了蜡块。

b、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；

c、选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；

d、一抗失效。

e、也可见于染色过程中漏掉某一环节，如忘加二抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

f、一般而言，我们承诺，病理技术部的所有流程为SOP流程，在同一实验重复实验无结果的情况下，可确定抗体失效或标本内部无相应抗原表达，为此公司不承担任何实验损失。

Q:流式细胞你们可以做吗？

A：需要知道测凋亡还是分选，是什么细胞？作为检测服务客户需要提供执行方案。

Q、细菌质粒抽提我们可不可以做？

A：质粒是细菌除了染色体外的，大量小环状DNA分子，抽提方法有小抽、中抽、大抽，也成为小提、中提、大提，是从菌液中提取的。主要区别是抽提量的不同，后期用途也不同。

小提，主要是从大肠杆菌中小量提取DNA，提取出来的DNA量比较少，纯度达不到细胞转染级别，只能用于后续的酶切，测序、载体构建等，一般适用于5ml以下菌液；

中提，小提基础上进一步去除菌液中内毒素，获得质粒可以用于细胞转染，常规需要的菌液量为10-15ml。

大提，与中提相同，可一次抽提100-300ml菌液，并获得大量质粒。

Q、如何判断所提取RNA的质量？

A：一般通过总量、纯度和完整性三大项检测来判断RNA的质量。

总量：微量分光光度计测260nm吸收值计算。

纯度：微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。

完整性：以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳，并以软件的RIN分数评估，10位RNA完整性最好，0为最差。

RNA质检参数中260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。其中：A230: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等。

A260：核酸的吸收峰测测RNA，DNA，引物等的浓度用的。

A280：蛋白质的吸收峰。一般的，我们只OD260/OD280(Ratio，R)在1.8~2.1范围内时，我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的；当R < 1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R > 2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了，而纯RNAOD260/OD280的比值为2.0。

Q、RNA的样本制备过程中如何避免降解？

A：（1）保持低温；

（2）尽量减少抽提时间，减少暴露在空气中的时间；

（3）使用DEPC水处理的耗材和试剂；

（4）使用RNA酶抑制剂；

（5）处理组织时，尽量灭活内源的RNA酶；

（6）使用正确的储存条件；

（7）操作过程中带口罩、手套、帽子。

Q、RNA相对表达量的计算？

A：计算公式：CPM=C/N*1000000

设C为比对到gene A的reads数（read count），N为比对到所有gene的总reads 数。

用途：在某些情况下，只想了解每个基因被覆盖到的相对reads数，而不希望对其做长度校正，就会使用这个指标。在某些RNA-seq文章或一些软件输出结果中会出现。

CPM只对read count相对总reads数做了数量的均一化。当如果想进行表达量的基因间比较，则不得不考虑基因长度的不同。如果进一步做长度的均一化，就得到下面的RPKM。

Q、蛋白质谱&蛋白芯片&代谢组学

A：蛋白质芯片是对目前已知的基因进行表达量的检测，在医学领域来讲，就是检测细胞生长、凋亡相关基因是否在特定条件下（药物治疗或疫苗接种后）转录、表达情况。

优点：

1.根据功能类别设计、蛋白功能明确、结果分析便捷；

2.可精细检测蛋白表达及修饰，适用于信号通路的研究；

3.灵敏度高，适用于血清/血浆；

4.适用于大批样本同步检测，批次重复性好，验证效率高。

缺点：仅可以检测芯片所含有的蛋白或抗体，物种属性有限，不适合植物和微生物。

蛋白质谱是为获得未知的基因蛋白或筛选有用蛋白而应用的技术手段，在获得的蛋白中既含有已知的蛋白，也有未知蛋白。

优点：可以获得未知的；可以做植物组的。

缺点：

1.可鉴定蛋白种类有限；

2.数据库庞大，依赖数据库和分析软件；

3.定性高、定量低；

4.不适用于大批量样本同步做。

应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）联合液相串联质谱技术分析骨关节炎患者关节液中差异蛋白，寻找潜在的骨关节炎生物标记物。每种定量方法有其特有的技术优点、局限性和适用范围。具体差异比较如下：

机器：Thermo Scientific™ Q Exactive HFX/plus

代谢组学（Metabonomics）是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成部分，认为代谢组是通过考察生物体系受扰动 或刺激后（如某个特定基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或代谢产物随时间变化来研究生物体系的代谢途径的一种技术。一般来说，代谢组学关注的对象是分子量在1000以下的小分子化合物。

优势：

1.分析由代谢物调控的细胞生命活动，如细胞信号释放，能量传递，细胞间通信等；

2.与转录组学和蛋白质组学比较，代谢组学专门研究生物体由于基因修饰或外界环境改变引起代谢物的变化，是最接近表型的组学，也是生物体系整体功能或状态的最终体现；

3.基因和蛋白表达的有效的微小变化会在蛋白级联反应生成代谢物的过程中得到放大从而使检测更容易；

4.代谢组不需建立序列标签（EST）数据库。

5.代谢产物和代谢途径在不同的生物体内具有相似性，可进行映射分析。

Q、蛋白质谱&蛋白芯片&代谢组学

A：检测血液样本中的某个蛋白指标，一般情况下：

1.不抗凝情况下，血液获得血清，检测血清中相关蛋白含量，用多因子检测、酶免方法或者生化方法；

2.血液中直接加入裂解液，WB检测相关蛋白表达。

不建议用血液做WB，类似的，我们在取脏器的时候，第一件事就是要把血液去掉，比如灌注或者漂洗。WB适用于组织、细胞等固态。液态样本建议做酶免相关实验。实验需要根据不同的样本和目的，选择合适的方法。有时候也要根据分子量选择不同的方法，比如分子量过大，就不适合做WB，可以用ELISA。

还有一个不同样本中蛋白丰度的问题，如果检测膝关节关节软骨退变，有些蛋白在关节软骨层，就要从软骨层提取蛋白，但有些分泌性蛋白在关节腔内的滑液中，就要选择滑液去检测。

还有一些蛋白就要选择免疫组化或免疫荧光的方法。核心是要明白这些蛋白本身的功能、活性、定位、表达过程等，才可以选择合适的方法。

Q、核蛋白、膜蛋白、还有线粒体蛋白，怎么分离？

A：目前分离核蛋白、胞蛋白还有细胞器蛋白主要是试剂盒分离提取的。

核蛋白和胞蛋白分离操作：通过细胞浆蛋白抽提试剂，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

检测方法：甲基化特异性的PCR、亚硫酸氢盐测序法、高分辨率熔解曲线法。

Q、CRISPLD2蛋白和成我们可以做吗？

A：构建个载体表达出来就好了。医生要是有现成的拿过来转染一下就好了。

Q、TMT你们是否可以做？

A：TMT技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用10种同位素的标签，标记多肽的氨基基团，经过LC-MS/MS分析，可同时比较10组不同样品中蛋白质的相对含量。

TMT技术是常用的差异蛋白质组学技术，在疾病标记物筛选、药物作用靶点、动植物抗病/抗胁迫机制、动植物发育分化机理等领域都有广泛应用。不过客户有这么大的样本量，不建议用TMT，用DIA更好，它可以使得个体与个体之间的重复性更好，更适合于大样本。

Q、检测服务结束后，客户可以收到什么资料？

A：理论上我们的客户检测类服务结束，会拿到：

1、项目报告；

2、原始结果；

其中项目报告包含内容有：

a.基本操作流程及关键环节信息；

b.实验关键环节的原始照片证据；

c.主要数据及分析（如果有付费）。